基于PAM-free LAMP-CRISPR/Cas12a (Cas-PfLAMP)的水稻病原体快速现场检测平台
水稻细菌性、真菌性和病毒性疾病严重威胁粮食生产与安全。现有检测方法（如传统培养、qPCR、免疫学方法等）存在依赖专业设备、耗时、成本高或存在交叉反应等缺陷，无法满足田间即时检测（POCT）的需求。
上海交通大学研究团队开发了一种无需PAM序列限制的环介导等温扩增偶联CRISPR/Cas12a检测新方法（Cas-PfLAMP），并结合侧流层析试纸条，用于水稻白叶枯病菌、水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒的快速、高灵敏、高特异且现场可视化诊断。
PAM-free LAMP扩增：为避免CRISPR/Cas12a系统对PAM序列（如TTTN）的严格依赖，本研究在LAMP引物（FIP）的F2与F1c连接区（Linker region）预插入了一个TTTT PAM序列，使得扩增产物天然包含可被Cas12a识别的PAM位点。这种“PAM-free”设计极大地提升了方法的通用性和灵活性。
CRISPR-Cas12a检测：利用设计好的特异性单链向导RNA引导FnCas12a蛋白识别并切割含PAM位点的LAMP扩增产物。此过程激活Cas12a的反式切割（trans cleavage）活性，无差别切割反应体系中的单链DNA荧光报告探针。
结果判读：开发了荧光实时监测和侧流层析试纸条（LFS） 两种可视化方案。
荧光法：使用FAM-淬灭基团标记的报告探针，阳性结果释放荧光。
试纸条法（LFS）：使用FAM-生物素双标记的报告探针，切割后产物在试纸条上显示检测线（T线），结果直观可视，无需任何仪器。
其中，使用的LFS是来自沃博生物warbio的CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条,货号JY0301。
“双保险”特异性：结合了LAMP引物（识别6个位点） 和CRISPR sgRNA特异性识别的双重精准识别机制，有效降低了传统LAMP因非特异性扩增导致的假阳性。
操作简便：全程恒温反应（LAMP：65°C；CRISPR/Cas12a切割：37°C），可使用便携式设备（如智能保温杯）加热，非常适合田间操作。
快速核酸提取：配套使用商业化固相核酸提取试剂盒，无需研磨叶片，5分钟内即可完成大批量样品处理。
对于水稻白叶枯病菌（XOO），检测限为9 拷贝/反应。
对于水稻条纹病毒（RSV） 和水稻黑条矮缩病毒（RBSDV），检测限均低至3 拷贝/反应。当结合试纸条（LFS）读数时，灵敏度略降为9 拷贝/反应。
灵敏度主要得益于LAMP的高效扩增和Cas12a反式切割的信号级联放大。
对包括其他黄单胞菌属细菌、多种水稻病毒在内的总计25种相关病原菌/病毒菌株进行交叉反应测试。
结果显示，三个Cas-PfLAMP检测体系均无交叉反应，特异性高达100%，仅对各自的目标病原体产生阳性信号。
从上海交通大学闵行校区水稻田中采集14份叶片样本，利用集成了固相提取、便携加热和LFS试纸条的完整现场平台进行检测。
操作全程仅需约60分钟（样品间并行处理）。检测结果与实验室传统PCR/RT-PCR和LAMP验证结果完全一致，证明了该平台在实际田间应用中的可靠性和实用性。
本研究成功构建了一个名为Cas-PfLAMP的检测平台。该平台的核心创新点在于通过改造LAMP引物“预埋”PAM序列，突破了CRISPR检测对靶标序列天然PAM位点的依赖性。结合开发的全流程现场检测平台（提取→扩增→试纸条判读），该系统实现了对水稻重要病原体的快速（~50-60分钟）、超灵敏（<10 拷贝）、高特异且无需专业设备的现场诊断。这一平台不仅能有效应用于水稻病害监测，其“PAM-free”设计理念也可扩展至其他动植物病害及各类核酸即时检测领域。
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货号
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产品
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规格
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TABAS03KIT
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TwistAmp Basic Kit DNA扩增试剂盒
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96T
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TAEXO02KIT
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TwistAmp exo 试剂盒
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96T
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B8201C1
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DNA恒温快速扩增试剂盒（DNA基础型）
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48T
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B8202C3
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DNA恒温快速扩增试剂盒（DNA荧光型）
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48T
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B8203C5
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DNA恒温快速扩增试剂盒（DNA试纸条型）
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48T
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B8204C7
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RNA恒温快速扩增试剂盒（RNA基础型）
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48T
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B8205C9
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RNA恒温快速扩增试剂盒（RNA荧光型）
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48T
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B8206C0
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RNA恒温快速扩增试剂盒（RNA试纸条型）
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48T
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JY0209
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双靶标HybriDetect侧向层析试纸条（彩虹型）
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50T
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JY0201
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单靶标HybriDetect侧向层析试纸条（彩虹型）
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50T
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JY0307
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CRISPR单酶切及扩增产物检测试纸条
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50T
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JY0301
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CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条
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50T
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JY0308
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CRISPR双酶切检测试纸条（变色龙）
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50T
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