一种单管RAA-CRISPR-Cas12a诊断平台，用于快速检测沙眼衣原体
沙眼衣原体作为全球高发的性传播病原体及可预防性致盲的主要病因，对人类健康构成严重威胁，可引发泌尿生殖道感染、沙眼及新生儿结膜炎等多种疾病。而传统检测方法依赖实验室设备、操作繁琐且耗时较长，难以满足基层及现场快速筛查的需求。
苏州大学附属南京中医药大学苏州医院、昆明医科大学延安医院等机构的研究团队开发了一种集成的单管RAA-CRISPR-Cas12a诊断平台，用于沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, CT）的快速、超灵敏和可视化检测。该平台结合了快速核酸裂解、等温扩增和CRISPR-Cas12a切割技术，并配套便携式掌上荧光检测仪和终端应用程序，旨在满足即时检测（POCT）的需求。
1.靶标基因：针对沙眼衣原体高度保守的基因组区域设计引物和向导RNA。
2.单管集成反应：采用创新的“管中管”结构，将重组酶辅助扩增（RAA）反应体系与CRISPR-Cas12a检测体系物理分隔在同一反应容器内。
第一步（39°C，20分钟）：位于内管的RAA体系对目标核酸进行等温扩增。
第二步（混合后，39°C，5分钟）：使用穿刺棒刺破内管底部，通过离心混合RAA扩增产物与位于外管的CRISPR-Cas12a检测试剂。Cas12a在crRNA引导下识别靶标DNA，激活其反式切割活性，切割单链DNA荧光报告探针（FAM标记），释放荧光信号。
3.信号读取：通过配套的便携式4通道荧光检测仪实时监测荧光动力学曲线，结果可通过连接的终端应用程序进行可视化判读。也可通过更换为生物素标记的探针，使用侧流层析试纸条进行结果判读。
其中，使用了沃博生物（warbio）RPA技术与相关试剂，CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条,货号JY0301。
1.引物与crRNA筛选：设计了4对RAA引物，通过凝胶电泳筛选出最优引物对（F1R1）。针对RAA扩增区域内的PAM位点（TTTN），设计了沙眼衣原体特异性的crRNA。
RAA反应体积：确定10 μL为最佳反应体积。
CRISPR-Cas12a反应体系：优化后确定Cas12a蛋白浓度为250 nM，crRNA浓度为200 nM时，切割效率最佳。
单管结构：优化后采用RAA体系15.5 μL，CRISPR体系40 μL的“管中管”设计，实现了理想的检测性能。
1.灵敏度：对沙眼衣原体质粒DNA进行10倍梯度稀释检测。该单管平台的检测限为10¹ 拷贝/mL。作为对比，实验中使用的qPCR方法的检测限为10² 拷贝/mL，表明该平台具有与qPCR相当甚至更优的灵敏度。
2.特异性：使用其他常见生殖道病原体（淋病奈瑟菌、解脲脲原体、白色念珠菌、阴道毛滴虫、阴道加德纳菌等）的DNA进行交叉反应测试。结果显示，仅沙眼衣原体样本产生阳性信号，与其他所有测试病原体均无交叉反应，证明了方法的高特异性。
使用87份临床阴道/宫颈拭子样本（残留样本）进行验证。
以qPCR作为参考方法（检出28例阳性，59例阴性）。
灵敏度：100.00% (95% CI: 87.66–100.00%)
特异性：98.31% (95% CI: 90.91–99.96)
总符合率：98.85% (95% CI: 93.76–99.97)
阳性预测值：96.55% (95% CI: 80.04–99.49)
阴性预测值：100.00% (95% CI: 93.84–100.00%)
结果表明，该平台与qPCR结果高度一致，即使在qPCR Ct值较高的样本中，也能观察到明显的荧光曲线上升。
1.真正的单管封闭系统：创新的“管中管”设计实现了RAA扩增与CRISPR检测在同一密闭管内的时空分离与混合，极大降低了气溶胶污染风险，简化了操作流程。
2.高灵敏度与特异性：结合了RAA的高效扩增和CRISPR-Cas12a的高特异性识别与信号放大，检测限低至10¹ 拷贝/mL，且无交叉反应。
3.快速便携：整个检测流程（包括5分钟核酸快速释放、20分钟RAA扩增和5分钟CRISPR切割）可在约30分钟内完成。配套的掌上荧光检测仪小巧便携，无需复杂温控程序，适合现场和基层医疗机构使用。
4.“基础RAA + CRISPR”策略优势：与需要复杂探针设计的等温扩增直接检测方法相比，该方法使用基础RAA引物进行扩增，依靠CRISPR-Cas12a实现特异性识别和信号转换，避免了非特异性信号，提高了检测的可靠性。
5.双模式读取：兼容实时荧光定量和侧流层析试纸条可视化读取，应用场景灵活。
本研究成功构建了一种基于单管RAA-CRISPR-Cas12a的沙眼衣原体快速、超灵敏、特异性检测平台。临床验证表明其性能与qPCR高度一致，为沙眼衣原体感染的早期诊断和现场筛查提供了一种强有力的新型技术手段。
原文链接：https://doi.org/10.1186/s13036-025-00591-z
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货号
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产品
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TABAS03KIT
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TwistAmp Basic Kit DNA扩增试剂盒
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96T
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TAEXO02KIT
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TwistAmp exo 试剂盒
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96T
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B8201C1
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DNA恒温快速扩增试剂盒（DNA基础型）
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48T
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B8202C3
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DNA恒温快速扩增试剂盒（DNA荧光型）
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48T
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B8203C5
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DNA恒温快速扩增试剂盒（DNA试纸条型）
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48T
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B8204C7
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RNA恒温快速扩增试剂盒（RNA基础型）
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48T
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B8205C9
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RNA恒温快速扩增试剂盒（RNA荧光型）
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48T
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B8206C0
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RNA恒温快速扩增试剂盒（RNA试纸条型）
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48T
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JY0209
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双靶标HybriDetect侧向层析试纸条（彩虹型）
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50T
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JY0201
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单靶标HybriDetect侧向层析试纸条（彩虹型）
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50T
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JY0307
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CRISPR单酶切及扩增产物检测试纸条
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50T
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JY0301
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CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条
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50T
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JY0308
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CRISPR双酶切检测试纸条（变色龙）
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50T
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