核糖核酸（缩写为RNA，即Ribonucleic Acid），存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A（腺嘌呤）、G（鸟嘌呤）、C（胞嘧啶）、U（尿嘧啶），其中，U（尿嘧啶）取代了DNA中的T（胸腺嘧啶）。核糖核酸在体内的作用主要是引导蛋白质的合成。

RNA是由磷酸二酯键连接的核糖核苷酸组成的核酸。与DNA不同，RNA含有核糖，其2'位有一个羟基，这使得RNA更容易水解和降解。RNA中发现的四种碱基是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)，其中尿嘧啶取代了DNA中的胸腺嘧啶。RNA以多种形式存在，每种形式具有不同的功能：

  ●mRNA（信使RNA）：携带遗传信息从DNA到核糖体，在那里被翻译成蛋白质。

  ●rRNA（核糖体RNA）：构成核糖体的核心结构和催化成分，核糖体是负责蛋白质合成的细胞机器。

  ●tRNA（转移RNA）：在蛋白质合成过程中将特定的氨基酸转移到核糖体。

  ●非编码RNA（ncRNA）：包括微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）和小核仁RNA（snoRNA），它们在细胞内发挥调节和结构作用。

我们研究RNA，绝大多数是研究mRNA即信使RNA，信使RNA有什么特点呢？

信使RNA是RNA的一种，主要功能是将DNA上的遗传信息传递到蛋白质合成机器——核糖体上，从而实现蛋白质的。信使RNA的结构简单，一般由一条单链RNA组成。mRNA的长度差异较大，

哺乳动物的mRNA长度一般在5×102～1×105个核苷酸，这种长度的差异使得mRNA能够携带更多的遗传信息。

mRNA的寿命相对较短，它们在完成遗传信息的传递任务后，就会被降解。这种短暂的寿命保证了生物体在生长发育过程中，能够根据需要及时调整蛋白质的合成，从而适应不断变化的环境。细菌mRNA的平均半衰期约为1.5分钟，而脊椎动物mRNA的半衰期则差异较大，平均约为3小时。一个完整的mRNA包括5'端帽、5'非翻译区、编码区、3'非翻译区和poly(A)尾链。

RNA分离方法

从生物样本中分离 RNA 通常采用提取方法，利用 RNA 和 DNA 之间的差异以及细胞成分的物理特性。其基本原理是破碎细胞以释放 RNA，然后将 RNA 与 DNA、蛋白质和其他细胞碎片分离。最常用的 RNA 分离技术包括：有机溶剂萃取（TRIzol法），硅胶柱纯化试剂盒，基于磁珠的RNA分离。

与DNA不同，RNA是极为脆弱的，由于其单链结构，RNA的碱基和氢键全都暴露在环境中，极易被环境中的各种化学物质和RNA酶降解。一旦降解，后期的实验纯属浪费时间了，然而这一过程往往是不易察觉。

如何判断从样本提取RNA质量，主要从‌完整性、纯度和浓度‌三个维度进行评估，这是确保后续实验（如qPCR、RNA-seq等）成功的关键步骤

一、RNA完整性检测：判断是否降解

 完整性反映RNA是否被RNase降解，常用以下方法：

1.‌琼脂糖凝胶电泳（推荐）‌

  ●真核生物总RNA应显示清晰的28S和18S rRNA条带，且28S条带亮度约为18S的1.5–2倍。

  ●若条带模糊、弥散或比例失衡（如28S明显弱于18S），提示RNA已降解。

  ●5S rRNA条带较弱，通常也能观察到。

  ●注意：mRNA在电泳图中表现为28S与18S之间的弥散背景，不属于降解。

 图中的条带从上到下分别为28S、18S、5S，这是真核生物的特征。28S和18S 条带最明亮、清晰、条带边缘锐利，最重要的是28S条带的亮度大概是18S条带的两倍或者以上，这种情况RNA的质量是很好的

二、RNA纯度检测：评估污染物残留

使用‌紫外分光光度计‌（如NanoDrop）测量吸光度比值：

  ●A260/A280 比值‌：评估蛋白质污染

  ●理想值为‌1.8–2.1‌，接近2.0为佳。

  ●<1.8 提示蛋白质或酚类残留；>2.1 可能表示RNA部分水解。

  ●A260/A230 比值‌：评估有机溶剂、盐类或碳水化合物污染

  ●正常值应‌>1.8–2.0‌，低于此值提示存在胍盐、酚或糖类污染。

  ●280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、溶液浑浊度、盐浓度和蛋白等有机物的值。我们只看OD260/OD280。理论上，纯RNA情况下的OD260/OD280的值为2，可接受的范围为1.8-2.0。纯的DNA情况下的OD260/OD280的值为1.8，可接受的范围是1.6-1.8。一般认为RNA中的蛋白或是其他有机物的污染是可以接受的，当R<1.8时，溶液中蛋白或是酚类物质残留。当R>2.2时，说明RNA已经水解为单核酸。一般的，如果你能做到1.9-2.0之间，说明RNA纯度已经很高了。但是如果你采用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会＞2(一般应＜2.2的)。

三、RNA浓度检测：确定可用量

1.‌紫外分光光度法（快速但易受干扰）‌

  ●利用A260吸光值计算浓度：RNA浓度(μg/mL)=A260×40×稀释倍数RNA浓度(μg/mL)=A260×40×稀释倍数（1个A260单位相当于约40 μg/mL RNA）。

2.‌荧光染料法（更准确，推荐用于微量样本）‌

  ●使用Qubit等荧光定量仪配合特异性RNA染料（如RiboGreen）

  ●优势：不受DNA、蛋白质或盐类干扰，灵敏度更高，适合低浓度样品。

判断RNA是否被酶（主要指‌RNase‌）污染，是分子生物学实验质量控制的关键步骤。RNA极易被无处不在的RNase降解，导致下游实验（如RT-qPCR、RNA-seq）失败。

上面几种方法都是采用物理的方法进行检测，但是我们无法得知所抽提的RNA是否有RNA酶污染。RNA酶比较顽强，单纯加温也很难灭活，必须使用DEPC。实验室环境中其实存在很多RNA酶，这些酶大多来源于人的呼吸和唾沫。你可以保证自己带口罩实验，但是你可能很难要求同处一室的其他人都带上口罩。很多高质量的实验室会开通PCR专用实验间，他们的实验往往比较顺利。

RNA保温试验（Incubation Test）

  1.将同一RNA样本分装两份。

  2.一份置于‌37°C或室温（如25°C）下保温30-60分钟‌，另一份置于‌冰上或-20°C保存‌作为对照。

  3.保温结束后，将两份样本同时进行琼脂糖凝胶电泳。

  ●结果判断‌：如果保温样本的电泳图谱出现明显降解（如28S条带减弱、smear增加），而对照样本完好，则‌强烈证明样本中存在活跃的RNase污染‌。

  ●下游酶反应失败‌：如果RNA样本在后续的‌逆转录（RT）或体外转录‌等实验中效率极低或完全失败，而实验体系对照正常，也高度提示RNA可能已降解或含有酶抑制剂。

问题排查

如果怀疑或确认RNA被RNase污染，请按以下步骤排查：

  1.‌检查电泳图谱‌：确认降解模式（部分或完全降解）。

  2.‌回顾提取过程‌：使用的试剂、耗材是否均为无RNase？是否全程在冰上操作？

  3.‌检查储存条件‌：RNA是否在-80°C长期保存？避免反复冻融，建议分装储存。

  4.‌进行保温试验‌：确认污染是否来自样本本身。

  5.‌设置阳性对照‌：在下次提取时，使用已知完好的细胞/组织样本作为对照，同步提取并电泳，以判断是样本问题还是操作体系问题。

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