工作原理:

Basic 采用增强型重组酶辅助扩增（Recombinase Aided Amplification, RAA）技术。该等温扩增方法在39 ~ 42℃恒温条件下进行。反应过程中，重组酶与引物形成复合体，介导引物侵入靶DNA模板，并在侵入位点打开双链或二级结构；单链结合蛋白随即结合到被打开的单链DNA上，维持其开链状态。当重组酶/引物复合体扫描至完全互补序列时，复合体解离，DNA聚合酶结合至引物3′端并启动新链合成。新合成的链作为后续循环的模板，经20 ~ 40分钟即可实现目标片段的指数级扩增。

 本试剂盒可于等温条件下快速扩增，无需热循环仪，兼具高灵敏度与强特异性。反应组分已预混并冷冻干燥成即用型颗粒，便于运输、储存和现场操作。冻干颗粒中包含重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、ATP、dNTPs（包括dUTP、dATP、dCTP、dGTP）、缓冲组分、poly A、TET、PEG 35000及其他必需试剂。启动反应仅需添加引物、探针（如适用）、模板核酸及镁离子（Mg²⁺），无需额外配制酶液。

引物和探针的设计是确保RPA/RAA反应高效、特异扩增的关键。推荐引物长度为28 ~ 35 nt，该长度较常规PCR引物更长，能够显著提升重组酶介导的链侵入效率。引物过短（< 28 nt）会降低重组酶与模板的结合效率，导致扩增失败或产量低下；反之，引物过长（> 35 nt）则容易形成二级结构（如发夹或二聚体），从而干扰反应特异性和整体性能。为获得最佳扩增效果，引物浓度需根据模板浓度进行优化筛选，建议通过梯度实验（如0.2 ~ 0.6 μM范围）确定最适浓度，以实现信号最强、背景最低的扩增结果。推荐扩增产物长度为80 ~ 500bp，模板DNA片段过长或出现重复序列时，扩增准确性和效率可能下降。为进一步提高设计成功率，建议优先选择GC含量40 ~ 60%的区域，确保引物与探针的Tm值接近，并通过BLAST验证序列特异性，避免交叉反应。

首次实验可从上述推荐参数入手，根据具体模板类型和浓度进行微调，以获得稳定可靠的扩增结果。

预期用途:

本试剂盒仅供科研使用，适用于各种DNA和RNA模板的扩增，核酸扩增产物可直接用于CRISPR检测，或经纯化后通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。

包装规格/货号:

包装规格：48次。

本产品默认不配套Mg²⁺，推荐醋酸镁终浓度为14 mM/Test；订购时请注明需配套醋酸镁。

储存条件及有效期:

本产品采用优化冻干工艺设计，具有优异的常温稳定性。未开封状态下，于25 ~ 30℃干燥、避光条件下储存，有效期12个月（活性保持≥ 95%）。开封后，盖紧瓶盖，继续于常温（25 ~ 30℃）干燥、避光条件下保存，有效期2个月。

操作步骤:

1. 样本处理

1) 动物样本处理

肌肉或内脏样品：首选脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓等。每份组织用手术剪取 0.05 g或3 mm见方的组织块于离心管内，①加入200 µL 5×闪电核酸释放剂（BT0066），95 ℃加热5 min，吸取上清液至一干净的离心管内，待检。②加入50 ~ 200 µL快闪核酸释放剂（BT0068）。

2) 植物样本处理

剪取2~3 mm见方的叶片，或长度约3 mm的根、茎、芽于离心管内，加入50 ~ 200 µL快闪核酸释放剂（BT0068），经简单研磨后，漩涡混合均匀，吸取上清液至一干净的离心管内，待检。

2. 反应体系的配制（单个样品/反应）：

建议加样顺序为阴性质控样本、待检样本和阳性对照，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。

3. 将上述反应体系混匀，使冻干粉充分溶解，该步骤可使用涡旋振荡器低速或脉冲模式轻轻涡旋3 ~ 5秒，或混匀盖紧管盖，上下颠倒混匀3 ~ 5次，瞬时离心后立即上机反应。

4. 将反应管放置在39 ~ 42℃条件下反应20 ~ 40min。

5. 反应结束后，立即从恒温仪中取出反应管。

6. 向每个反应管中加入50 μL酚/氯仿混合液。充分振荡混匀（推荐使用涡旋振荡器剧烈振荡10 ~ 15秒），然后以12,000 rpm离心1分钟，使水相与有机相分层。

7. 吸取10 μL上清液（水相），进行琼脂糖凝胶电泳分析。推荐胶浓度为1.5% ~ 2.0%（可根据扩增片段大小调整）。

8. 电泳后使用适当染色方法（如EB或GelRed）观察结果。

检测灵敏度:

本试剂盒检测极限10 ~ 100拷贝/测试（依据引物筛选优化程度和检测手段）。

注意事项及安全提示:

1. 本产品仅供科研使用。使用前请仔细阅读说明书，严格按照说明书操作。违反或者未按说明书进行操作可能导致错误结果。

2. 产品应依照说明书要求，储存于合适的环境和温度下，并在有效期内使用。储存不当或产品过期可能导致错误结果。

3. 为避免交叉污染，试剂配制区及检测区应分隔开。

4. 实验需设置不加模板的空白对照，以确认是否有待扩增核酸的污染。

5. 如用于病毒等病理样品检测，所有检测样本及试剂均按照传染性物质对待，实验过程中穿工作服，戴一次性手套，并经常更换手套，以做好工作人员的防护并避免交叉污染。

6. 不能使用过有效期的产品。注意事项 本试剂盒仅限科研用途。为获得最佳结果，请严格遵循本说明书提供的操作流程，并设置适当对照。

免责声明：

本产品采用自主研发的RAA技术增强方案，适于现场快速检测和即时诊断应用，与任何第三方专利方法无关。