工作原理:

RPA Basic 采用增强型重组酶辅助扩增（Recombinase Aided Amplification, RAA）技术。该等温扩增方法在39 ~ 42℃恒温条件下进行。反应过程中，重组酶与引物形成复合体，介导引物侵入靶DNA模板，并在侵入位点打开双链或二级结构；单链结合蛋白随即结合到被打开的单链DNA上，维持其开链状态。当重组酶/引物复合体扫描至完全互补序列时，复合体解离，DNA聚合酶结合至引物3′端并启动新链合成。新合成的链作为后续循环的模板，可实现目标片段的指数级扩增。荧光/试纸条型试剂盒含有外切酶或Nfo核酸酶，专为实时荧光检测或侧流免疫层析试纸条（LFS）可视化读数而设计。

 本试剂盒可于等温条件下快速扩增，无需热循环仪，兼具高灵敏度与强特异性。反应组分已预混并冷冻干燥成即用型颗粒，便于运输、储存和现场操作。冻干颗粒中包含重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、外切酶或Nfo核酸酶、ATP、dNTPs（包括dUTP、dATP、dCTP、dGTP）、缓冲组分、poly A、TET、PEG 35000及其他必需试剂。启动反应仅需添加引物、探针（如适用）、模板核酸及镁离子（Mg²⁺），无需额外配制酶液。

引物和探针的设计是确保RPA/RAA反应高效、特异扩增的关键。推荐引物长度为28 ~ 35 nt，该长度较常规PCR引物更长，能够显著提升重组酶介导的链侵入效率。引物过短（< 28 nt）会降低重组酶与模板的结合效率，导致扩增失败或产量低下；反之，引物过长（> 35 nt）则容易形成二级结构（如发夹或二聚体），从而干扰反应特异性和整体性能。为获得最佳扩增效果，引物浓度需根据模板浓度进行优化筛选，建议通过梯度实验（如0.2 ~ 0.6 μM范围）确定最适浓度，以实现信号最强、背景最低的扩增结果。

探针的设计需根据检测方式进行针对性调整。一般而言，探针长度与引物相当（28 ~ 35 nt），序列应与靶DNA高度特异互补。为进一步提升杂交稳定性和切割效率，可在探针内部引入碱基类似物替换，例如四氢呋喃残基（THF，或称dSpacer）。在荧光型检测中，探针的THF位点上游标记发光基团（如FAM），下游标记淬灭基团（如BHQ1），从而实现实时或终点荧光读数；在侧流免疫层析试纸条（LFS）可视化检测中，探针5′端需标记抗原标签（如FAM或羧基荧光素），以便试纸条捕获，而3′端必须添加聚合酶延伸阻断基团（如C3-spacer、磷酸基或双脱氧核苷酸），防止非特异性延伸。探针序列设计时，应避免与引物或模板形成明显二级结构或非特异杂交，建议使用专业软件（如Primer Premier或OligoAnalyzer）进行评估和优化。

推荐扩增片段长度为80 ~ 300 bp，这一范围可获得最佳的扩增速度、产量和特异性。片段过长（超过300 bp）会显著降低扩增效率和准确性；若模板中含有重复序列或极端GC/AT偏倚区域，则可能导致非特异扩增或产物不均一。为进一步提高设计成功率，建议优先选择GC含量40–60%的区域，确保引物与探针的Tm值接近，并通过BLAST验证序列特异性，避免交叉反应。

首次实验可从上述推荐参数入手，根据具体模板类型和浓度进行微调，以获得稳定可靠的扩增结果。

预期用途: 

本试剂盒仅供科研使用，适用于各种DNA和RNA模板的扩增，建议使用荧光读数仪或便携式荧光检测设备进行实时或终点荧光检测，或使用侧流免疫层析试纸条（LFS）进行裸眼观察或仪器读数可视化检测。

本试剂盒核酸扩增产物不适合直接用于琼脂糖凝胶电泳（可能导致条带弥散、模糊、极弱或完全缺失），也不适合直接用于下游CRISPR/Cas系统分析（如Cas12a/Cas13a转位切割实验），可能引起信号异常、假阴性结果或背景干扰升高。

包装规格/货号:

包装规格：48次，货号BC0808。

本产品默认不配套Mg²⁺，推荐醋酸镁终浓度为14 mM/Test；订购时请注明需配套醋酸镁。

储存条件及有效期:

本产品采用优化冻干工艺设计，具有优异的常温稳定性。未开封状态下，于25 ~ 30℃干燥、避光条件下储存，有效期12个月（活性保持≥ 95%）。开封后，盖紧瓶盖，继续于常温（25 ~ 30℃）干燥、避光条件下保存，有效期2个月。

操作步骤:

1. 样本处理

1) 动物样本处理

肌肉或内脏样品：首选脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓等。每份组织用手术剪取 0.05 g或3 mm见方的组织块于离心管内，①加入200 µL 5×闪电核酸释放剂（BT0066），95 ℃加热5 min，吸取上清液至一干净的离心管内，待检。②加入50 ~ 200 µL快闪核酸释放剂（BT0068）或星闪核酸释放剂（BT0069）。

2) 植物样本处理

剪取2~3 mm见方的叶片，或长度约3 mm的根、茎、芽于离心管内，加入50 ~ 200 µL快闪核酸释放剂（BT0068）或星闪核酸释放剂（BT0069），经简单研磨后，漩涡混合均匀，吸取上清液至一干净的离心管内，待检。

2. 反应体系的配制（单个样品/反应）：

建议加样顺序为阴性质控样本、待检样本和阳性对照，每个样本添加完毕后均需立即扣好管盖，避免气溶胶污染。

3. 将上述反应体系混匀，使冻干粉充分溶解，该步骤可使用涡旋振荡器低速或脉冲模式轻轻涡旋3 ~ 5秒，或混匀盖紧管盖，上下颠倒混匀3 ~ 5次，瞬时离心后立即上机反应。将反应管放置在39 ~ 42℃条件下反应10 ~ 20min。

4. 反应结束后，立即从恒温仪中取出反应管。吸取适量体积的扩增产物，并以超纯水对扩增产物进行20~200倍的稀释后，确保稀释产物总体积为50 ~ 100 μL。

5. 根据检测样品数量取出相应数量的侧流免疫层析试纸条（LFS），每根试纸条只能用于单次、单个样品的检测。将试纸条结合垫标记有Max箭头的一端插入装有稀释扩增产物的EP管内，液面不得超过结合垫最上端，待判读区全部浸润，质控线显色（约1 ~ 2 min）。根据试纸条检测线显色情况直接读取检测结果。

6. 5 min内观察结果，10min后判读无效。记录检测结果，将试纸条密封丢弃在安全处。

检测灵敏度:

本试剂盒检测极限10 ~ 100拷贝/测试（依据引物筛选优化程度和检测手段）。

注意事项及安全提示:

1. 本产品仅供科研使用。使用前请仔细阅读说明书，严格按照说明书操作。违反或者未按说明书进行操作可能导致错误结果。

2. 产品应依照说明书要求，储存于合适的环境和温度下，并在有效期内使用。储存不当或产品过期可能导致错误结果。

3. 为避免交叉污染，试剂配制区及检测区应分隔开。

4. 实验需设置不加模板的空白对照，以确认是否有待扩增核酸的污染。

5. 如用于病毒等病理样品检测，所有检测样本及试剂均按照传染性物质对待，实验过程中穿工作服，戴一次性手套，并经常更换手套，以做好工作人员的防护并避免交叉污染。

6. 不能使用过有效期的产品。注意事项 本试剂盒仅限科研用途。为获得最佳结果，请严格遵循本说明书提供的操作流程，并设置适当对照。

免责声明：

本产品采用自主研发的RAA技术增强方案，适于现场快速检测和即时诊断应用，与任何第三方专利方法无关。