产品简介

enLbCas12a（enhanced LbCas12a）是一种基于野生型LbCas12a核酸内切酶升级改造获得的高活力LbCas12a突变体。与野生型LbCas12a的作用机制一样，enLbCas12a也通过crRNA介导，靶向识别带有PAM序列（5’-TTN-3’）的双链DNA，使DNA双链断裂并产生粘性末端。同时，enLbCas12a对单链DNA靶标的识别和剪切不依赖PAM序列。双链或单链DNA靶标均能激活enLbCas12a的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附属剪切活性)，即当enLbCas12a酶与crRNA、靶标DNA结合形成三元复合物后，便会被激活针对非特异ssDNA序列的反式剪切活性，将体系中的ssDNA序列切碎。因此，enLbCas12a酶不仅可用于体外dsDNA的特异剪切，也可用于靶标核酸的快速检测。

产品组分

组分	32135-01 (100 pmol)	32135-03 (1,000 pmol)
enLbCas12a Nuclease (10 μM) a	100 pmol	1,000 pmol
10×HOLMES Buffer for Cas12a	1 mL	1 mL

a. enLbCas12a Nuclease浓度为10 μM，即10 pmol/μL；100 pmol规格的总体积为10 μL，1,000 pmol规格的总体积为100 μL；

保存条件

-80℃或-20℃储存；干冰运输。

活性定义

在总体积为20 μL的1 × HOLMES Buffer for Cas12a [pH 8.5]反应体系中，37℃反应条件下，1 min内剪切1 pmol ssDNA探针所需的Cas12a酶量定义为1 transU。

例：若某批次enLbCas12a酶的反式切割活性为80.0 transU/pmol，则表明1 pmol的该批次enLbCas12a酶可在1 min内，在上述指定的反应条件下，反式切割80 pmol ssDNA探针。

实验流程

1. 顺式剪切实验

b. 顺式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。

若用核酸电泳来分析顺式剪切产物，建议使用dsDNA靶标，因为ssDNA靶标会被反式激活的Cas12a进一步切碎。对于20 μL顺式剪切应体系，推荐target DNA的使用量为100 ng～500 ng，且target DNA片段长度在300 bp～3 kb范围内。不同长度target DNA需要的Cas酶和crRNA的量需要根据target DNA的摩尔量计算，建议保持Cas酶:crRNA:target DNA的摩尔比为10:10:1，以尽量确保target DNA被剪切完全。

37℃反应30 min ~ 1 h，85℃灭活5 min，核酸电泳分析顺式剪切产物。

2. 反式剪切实验

c. 反式剪切体系中Target DNA可为ssDNA或带PAM序列的dsDNA。

反式剪切体系中各组分的用量可以根据不同的实验目的进行调整，用量较少时可先将各组分稀释后加入体系，enLbCas12a Nuclease可用1×HOLMES Buffer for Cas12a稀释，稀释后需立即使用（若要稀释后的Cas12酶长期保存，请使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），crRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀释，但极低浓度的Target DNA（例如LOD实验）建议用0.1% Tween 20稀释并使用低吸附的离心管、吸头等耗材。

实时荧光定量PCR仪检测荧光信号，37℃反应，每30 sec采集一次荧光信号。

实验结果

顺式剪切	反式剪切

 

注意事项

1. 高活力的enLbCas12a酶crRNA的DR序列（Direct Repeat）与野生型LbCas12a（#32108）一致，可以在反应体系中用enLbCas12a酶直接替换野生型LbCas12a。
2. 不同来源的Cas12a酶，其识别靶标所需的PAM位点也略有不同，其中大部分Cas12a酶可识别TTN或TTTN位点。
3. Cas12a的顺式剪切(cis-cleavage)：Cas12a在crRNA的引导下，特异性地剪切target DNA。dsDNA靶标需带有PAM位点，而ssDNA靶标不依赖PAM位点。
4. Cas12a的反式剪切(trans-cleavage)：当target DNA存在时，Cas12a/crRNA与target DNA形成三元复合物(Cas12a/crRNA/target DNA)，同时，Cas12a被激发反式剪切活性，将反应体系中任意序列的单链DNA切碎。
5. 利用本产品的反式剪切活性进行分子诊断实验，可参考本公司的HOLMES体系[1]。
6. 为防止RNase污染，请保持实验区干净整洁，操作时需穿戴干净的手套、口罩，实验所用枪头、离心管等耗材均为RNase-free。
7. Cas12a酶对热敏感，容易失活，应全程冰上配置反应体系，并在使用后立即将酶置于-20℃保存。
8. 本产品仅供科研使用。