脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征，病情凶险，病死率高，其病原微生物包括细菌、真菌、病毒及寄生虫等，对医疗保健构成重大威胁。在确定细菌感染后进行快速干预是预防败血症的关键，但仅有约45%的脓毒性休克患者可获得阳性血培养结果，这大大制约了脓毒血症的确诊。为了克服传统方法的局限性，快速诊断是十分重要的。与传统的基于培养物的平板计数方法相比，之前的研究通常使用表面增强拉曼光谱学（SERS），表面等离子体共振（SPR）或电化学方法等，尽管这些方法可以在医院中提供更直接的细菌感染筛查，但通常制造复杂且成本高昂，或者需要大量的预处理步骤，其灵敏度和特异性也存在一定局限性，以至于无法被更广泛地应用。因此，急需开发一种检测败血症诱导细菌的经济实惠、可重复使用、灵敏可靠的POC生物传感器。
成果简介在该策略中，研究人员开发了一种GO-CRISPR传感器，利用重组酶聚合酶扩增（RPA）技术和靶激活的Cas12a反式切割技术，将短的单链DNA探针（结合到单层氧化石墨烯上荧光猝灭）从GO中分离出来，以恢复荧光信号用于检测。RPA用于细菌DNA的等温扩增，避免了基因扩增对复杂仪器的依赖。在人体的血清复杂环境中，GO-CRISPR系统对鼠伤寒沙门菌（S.Typhimurium）的检测限低至3×103 CFU/mL，对其他竞争细菌（金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，霍乱弧菌等）干扰实验中，表现出良好的特异性。此外，该传感器提供了显著的肉眼荧光，从样本采集到信号读出的总时间不到1.5小时。综上所述，所构建的GO-CRISPR系统为脓毒症诱导细菌的检测提供了优越的时效性，并有可能在资源有限的环境中加强细菌感染的早期检测，加快检出脓毒症风险患者的速度。
文章以“On-Site Fluorescent Detection of Sepsis-Inducing Bacteria using a Graphene-Oxide CRISPR-Cas12a (GO-CRISPR) System”发表在Analytical chemistry上。本文的通讯作者是来自美国弗吉尼亚理工大学的Juhong Chen。
图文解析
图1。使用GO-CRISPR系统检测沙门氏菌的示意图。采用等温重组酶聚合酶扩增(RPA)技术扩增沙门氏菌invA基因。扩增的沙门氏菌靶DNA随后与专门设计的CRISPR系统和ssDNA-FAM探针反应。在目标DNA存在的情况下，CRISPR系统被激活，启动探针的稳健降解。降解的探针不能与氧化石墨烯表面结合，从而产生荧光信号，用于沙门氏菌的视觉检测。
图2。GO-CRISPR系统的表征。(a)距离依赖性氧化石墨烯荧光猝灭示意图。荧光探针上的ssDNA通过π−π堆叠相互作用附着在氧化石墨烯表面。荧光在靠近氧化石墨烯的地方熄灭。(b) 510 ~ 600 nm范围内不同浓度氧化石墨烯的荧光光谱。(c)不同浓度氧化石墨烯在520 nm处的荧光强度。(d)荧光图像和强度，用于GO-CRISPR系统可行性分析。
图3。GO-CRISPR系统的优化。(a,b)不同浓度Cas12a在520 nm处的荧光光谱和强度。(c,d)不同浓度crRNA在520 nm处的荧光光谱和强度。(e,f) GO-CRISPR系统在37℃和室温下520 nm处的荧光强度和30 min时的图像。
图4。沙门氏菌DNA检测。(a)不同浓度DNA的荧光光谱。(b)不同浓度DNA在520 nm处的荧光强度值与背景的比值，动态范围线性回归。(c)用于检测不同浓度沙门氏菌DNA的GO-CRISPR系统的荧光图像。
图5。GO-CRISPR系统检测沙门氏菌的灵敏度和特异性。(a)用于沙门氏菌特异性检测的RPA扩增和GO-CRISPR系统示意图。(b)不同浓度鼠伤寒沙门氏菌RPA产物的凝胶图像和荧光强度(NC =阴性对照)。(c)血清型沙门氏菌RPA产物的凝胶图像和荧光强度。(d)有和没有鼠伤寒沙门氏菌的竞争菌株(枯草芽孢杆菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生乳杆菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌和所有五种培养物的“混合物”)的RPA产物和荧光强度的凝胶图像。
图6。人血清中沙门氏菌的检测。(a)检测人血清中沙门氏菌的GO-CRISPR整个过程示意图。(b)人血清中不同浓度鼠伤寒沙门氏菌的荧光光谱。(c) RPA产物的凝胶图像和不同浓度鼠伤寒沙门氏菌在人血清中的荧光强度。(d)人血清中不同浓度鼠伤寒沙门氏菌的荧
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RPA试剂盒及试纸条系列：
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货号 |
产品 |
规格 |
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JY0209 |
双靶标HybriDetect侧向层析试纸条（彩虹型） |
50T |
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JY0201 |
单靶标HybriDetect侧向层析试纸条（彩虹型） |
50T |
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JY0307 |
Tiosbio® CRISPR单酶切及扩增产物检测试纸条 |
50T |
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JY0301 |
CRISPR Cas12/13 HybriDetect试纸条 |
50T |
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JY0308 |
Tiosbio® CRISPR双酶切检测试纸条（变色龙） |
50T |
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WLB8201KIT |
DNA恒温快速扩增试剂盒（基础型） |
48T |
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WLE8202KIT |
DNA恒温快速扩增试剂盒（荧光型） |
48T |
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WLN8203KIT |
DNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型） |
48T |
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WLRB8204KIT |
RNA恒温快速扩增试剂盒（基础型） |
48T |
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WLRE8205KIT |
RNA恒温快速扩增试剂盒（荧光型） |
48T |
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WLRN8206KIT |
RNA恒温快速扩增试剂盒（胶体金试纸条型） |
48T |
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WLB5001 |
DNA恒温快速扩增试剂盒（液体基础型） |
100T |
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WLN5002 |
DNA恒温快速扩增试剂盒（液体胶体金型） |
100T |
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WLR5003 |
DNA恒温快速扩增试剂盒（液体荧光型） |
100T |
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WLRB5001 |
RNA恒温快速扩增试剂盒（液体基础型） |
100T |
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WLRN5002 |
RNA恒温快速扩增试剂盒（液体胶体金型） |
100T |
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WLRE5003 |
RNA恒温快速扩增试剂盒（液体荧光型） |
100T
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Cas酶系列
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货号 |
包装规格 |
中文名称 |
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32108-01 |
100 pmoL |
LbCas12a (Cpf1) |
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32108-03 |
1,000 pmoL |
LbCas12a (Cpf1) |
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32117-01 |
100 pmoL |
LwaCas13a (C2c2) |
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32117-03 |
1,000 pmoL |
LwaCas13a (C2c2) |
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AapCas12b (C2c1) |
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32118-03 |
1,000 pmoL |
AapCas12b (C2c1) |
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100 pmoL |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
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1,000 pmoL |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
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AsCas12a (Cpf1) |
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AsCas12a (Cpf1) |
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AacCas12b (C2c1) |
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AacCas12b (C2c1) |
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FnCas12a (Cpf1) |
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Lb5Cas12a (Cpf1) |
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Sp-dCas9 |
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32120-01 |
100 pmoL |
Sp-nCas9（H840A） |
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1,000 pmoL |
Sp-nCas9（H840A） |
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