抗性淀粉检测试剂盒(微量法100T/96S）
| 货号 | SH0635 | 售价（元） | 3000 |
| 规格 | 100T/96S | CAS号 |
- 产品简介
- 相关产品
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货号 |
名称 |
规格 |
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SH0635 |
抗性淀粉检测试剂盒(微量法100T/96S） |
100T/96S |
抗性淀粉（RS）是指在人小肠内不能被酶解的淀粉，在大肠部分或完全发酵。RS是总膳食纤维的组分之一。
抗性淀粉的测定方法： 样品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（AMG）37℃振荡水浴孵育16小时，在这期间，通过两种酶的联合作用，非抗性淀粉被溶解，水解成D-葡萄糖，孵育结束后，加入等体积的乙醇或工业甲基化酒精（IMS,变性乙醇）终止反应。离心上述溶液，收集上清勿弃，底部残留絮状团即为样品中的RS，用含水的IMS或乙醇（50%v/v）洗涤絮状团，洗涤后离心，再重复一次洗涤离心，收集离心后获得的上清，与之前收集的上清混合。小心倒出试管残留的液体，将絮状团置于冰水浴中，加入2M KOH溶解，溶解的同时用磁力搅拌机剧烈搅拌。用醋酸盐缓冲液将这个溶液调至中性，用AMG将淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂（GOPOD）测定，这也是对样品中RS含量的测定。非抗性淀粉（可溶性淀粉）的测定可通过集中的上清液并定容至100ml，再用GOPOD测定D-葡萄糖完成。
应用性和精确性
这个方法需要样品中RS含量多于2% w/w，如RS含量多于2% w/w，常规标准误差为±5%，少于2% w/w RS的误差更高。
试剂盒组成与配制
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试剂名称 |
储存条件 |
SH0635-100T |
注意事项 |
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试剂一 |
-20℃ |
液体5ml×1瓶
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用之前可分为适当大小的等分试样，并在使用期间储存在-10℃以下的聚丙烯管中，如有可能，在使用过程中保持冷却。（未配制时在-20℃稳定2年以上，配制使用后在-20℃稳定1~3个月） |
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试剂二 |
-20℃ |
粉剂5g×1瓶
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用100ml顺丁烯二酸钠缓冲液(100mM，pH6.0)悬浮1g试剂二中的产品，搅拌5分钟。加入1.0ml稀释后试剂一（过程见：溶液/悬浮液的制备），混匀，>1500g离心10分钟，慢慢倒出上清液，这就是制备的试剂二。（试剂二制备后应当天使用） 注：可根据实验过程中的使用量适量配制 |
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试剂三 |
4℃ |
粉剂×1瓶 |
加500ml蒸馏水溶解混匀，用pH计调节至pH7.4，最后用蒸馏水定容至500ml，即为试剂三。（pH若高于7.4，用1M磷酸二氢钾和0.22M对羟苯甲酸的混合液调pH至7.4，pH若低于7.4，用1M磷酸三钾和0.22M对羟苯甲酸的混合液调pH至7.4） |
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试剂四 |
-20℃ |
粉剂 mg×1瓶
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用20ml试剂三缓冲液溶解试剂四中的内容物，并将其定量转移到含有剩余试剂三缓冲液的瓶子中。用铝箔盖住这个瓶子，以保护密封的试剂不受光照，此试剂为 GOPOD试剂。（未配制时在2-5℃或＜-10℃下存放超过12个月，配制使用后在2-5℃或＜-20℃可稳定1~3个月） 备注：如果该试剂要以冷冻状态储存，则最好将其分为200 ml的小份，在使用过程中仅冷冻/解冻一次。 新制备试剂时，其颜色可能为浅黄色或浅粉色。在4°C下，2-3个月后，若该溶液将呈现出更强烈的粉红色应立即对照蒸馏水读数，吸光度应小于0.05，若大于此数值，则表示该溶液不可再使用。 |
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标准品 |
4℃ |
液体5ml×1瓶
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D-葡萄糖标准溶液（5 ml，1.0 mg/ml）
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溶液/悬浮液的制备
使用瓶子1中提供的的产品（试剂一），这个溶液是有粘性的，因此应使用移液器移取分装。（4℃下稳定性> 3年）稀释后试剂一：取2 ml瓶子1中溶液用100mM pH6.0顺丁烯二酸钠缓冲液稀释至22ml。（注：以5 ml为单位分装后用聚乙烯管冷冻保存，反复冻融不会影响稳定性，稳定性-20℃ >5年）
没有提供的试剂（应购买分析纯级）
1.顺丁烯二酸钠（马来酸钠）缓冲液(100mM，pH6.0)加上2mM二水氯化钙和叠氮化钠（0.02%w/v）：用1600ml蒸馏水溶解23.2g顺丁烯二酸，用4M（160g/L）氢氧化钠调节pH至6.0，加入0.6g二水氯化钙和0.4g叠氮化钠，混合并溶解，定容至2L。（4℃下可保存一年）
2.醋酸钠缓冲液（1.2M，PH3.8）：将69.6ml的冰醋酸（1.05g/ml）加至800 ml的蒸馏水中，用4M氢氧化钠调节pH至pH3.8，用蒸馏水定容至1L。（室温下可保存一年）
3.醋酸钠缓冲液（100mM，PH4.5）：将5.8ml的冰醋酸加至900 ml的蒸馏水中，用4M氢氧化钠调节pH至4.5，用蒸馏水定容至1L。（4℃保存2个月）
4.氢氧化钾溶液（2M）：将112.2gKOH加至900 ml的去离子水中，搅拌溶解。定容至1L，密封保存。（室温下可保存2年）
5.含水乙醇（或者IMS）（大约50%v/v）：将500ml乙醇（95%v/v或者99%v/v）或者工业甲基化酒精（IMS；变性乙醇；95% v/v 乙醇加上5%甲醇）至500ml的水中，密封保存。（室温下稳定保存>2年）
设备（推荐）
1. 离心式粉碎机，带有齿轮转子和1.0mm筛子，或类似的装置。小型样品可选择旋风磨碎机替代
2.绞肉机-手动或电动的，装有4.5mm筛
3.台式离心机-能够放入16×120mm玻璃试管，速度大约1500g(3000rpm)
4.振荡水浴器，可设定为每分钟100次直线运动（振荡速度为每分钟200里程），振荡距离35mm,37℃
5.水浴锅-能够保持在50+0.1℃
6.涡旋混匀器
7.磁力搅拌器
8.磁力搅拌棒-5×15mm
9.pH计
10.计时器
11.分析天平（精确到0.1毫克）
12.分光光度计-能够设定510nm（10mm路径长度）
13.100μL移液器及一次性枪头
14.连续分配器配有50ml管嘴，能够移取2.0ml，3.0ml和4.0ml
15.培养管-螺旋帽，16×125mm
16.玻璃试管-16×100mm，14ml容量
17.塑料盒，可放置试管架，也可作为冰盒使用
18.温度计-能够读取37+0.1℃和50+0.1℃
19.容量瓶-100ml，200ml，500ml，1L，2L
样品制备
用磨碎机研磨大约50g谷物样品或冻干植物或食品，使样品粉末可过1.0mm筛，转移所有的材料至广口瓶，颠倒振荡混匀。工业淀粉一般不用研磨，用绞肉机粉碎鲜样（如罐装的豆子，香蕉，土豆），过4.5mm筛，测定干样中的含水量，根据AOAC法925.10，冻干后烘炉干燥测定鲜样中的含水量。
分析方法
（a）水解和溶液化非抗性淀粉
1.准确称取100mg（±5 mg）样品后直接倒入有螺旋帽的试管里，轻柔的拍打试管以保证样品集中在底部。
注意：对于湿样，样品大概为0.5g（准确称重），这些材料的含水量通常为60-80%。
2.每个试管中加入4.0 ml试剂二。
3.盖紧试管盖子，用涡旋振荡器混匀，卧式放入振荡水浴器，与运动方向平行。
如下图所示：
5.把试管从水浴锅中拿出，用纸巾擦掉多余的水，拿开盖子，加入4.0ml乙醇（99% v/v）或者IMS（99% v/v），用涡旋器涡旋。
6.1500g离心，10分钟（不加盖）。
7.小心倒出上清，加入2ml 50%乙醇或50% IMS重悬浮，用涡旋器涡旋，再加入6ml 50%IMS，混合，1500g离心，10分钟。
8.小心倒出上清，重复上述重悬浮和离心步骤。
9.小心倒出上清，翻转试管，用纸巾吸除多余的液体。
（b）测定抗性淀粉含量
1.将试管冰浴，再向每个试管中加入磁力搅拌棒和2 ml 2M的KOH，用磁力搅拌机在冰浴/水浴状态下搅拌20min，以重悬浮絮状物和溶解RS。
如下图所示：
备注：
（1）不要使用涡旋器混匀，那将会导致淀粉乳化。
（2）确保边加入KOH溶液边剧烈搅拌试管里的样品，这将会避免形成难溶的淀粉块。
2.向每个试管中加入8 ml （1.2M pH3.8）醋酸钠缓冲液，并用磁力搅拌机搅拌，立即加入0.1ml试剂一,混匀，并放入50℃水浴。
3.孵育30min,期间用涡旋器间歇混匀。
4.对于RS含量>10%的样品，用水洗瓶定量转移试管里的样品至100ml容量瓶，当用洗瓶洗涤试管中的溶液时用外磁铁保持试管中的磁力棒，用蒸馏水定容至100ml，并混匀，以单位体积离心溶液，1500g，10min。
5.对于RS含量<10%的样品，直接离心1500g,10min（非稀释），对于这些的样品，试管里的最终体积大约为10.3ml。（体积可能会变化，如果分析的是湿样，在计算数值时应注意折扣）
6.将稀释的（4）或非稀释的（5）上清液以0.05ml为单位转移至玻璃试管（16×100mm），一式两份，加入1.5mlGOPOD试剂，50℃孵育20分钟。
7.孵育完成后各取出200ul溶液，分别测量每一个溶液的在510nm下相对于空白试剂的吸光度值。（备注：反应结束后，放冷5min内测完结果）
制备空白试剂
准备空白试剂：通过混匀0.05ml的100mM的醋酸钠缓冲液（pH4.5）和1.5ml的GOPOD试剂，孵育完成后各取出200ul溶液进行同上检测。
制备D-葡糖糖标准品（一式四份）通过混合0.05mlD-葡萄糖（1mg/ml）和1.5ml的GOPOD试剂，孵育完成后各取出200ul溶液进行同上检测。
（c）计算非抗性（可溶性的）淀粉
1.收集起始孵育[(a)7]过程中离心获得上清液和两次50%乙醇洗涤[(a)8和9]获得的上清液至容量瓶中，用100mM的醋酸钠缓冲液（pH4.5）定容至100ml，混匀。
2.以0.05 ml为单位孵育溶液（一式两份）并加入5μL稀释试剂一, 50℃孵育20分钟,加入1.5 ml GOPOD试剂，50℃孵育20分钟，孵育完成后各取出200ul溶液，分别测量每一个溶液的在510nm下相对于空白试剂的吸光度值。（备注：反应结束后，放冷5min内测完结果）
3.计算在510nm下相对于空白试剂的吸光度值。
4.计算非抗性淀粉的含量。
计算
计算样品中抗性淀粉含量，非抗性淀粉含量和总淀粉含量（%，在干重的基础上），计算模板如下：
抗性淀粉（g/100g样品）（样品包含>10%RS） = ΔE×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180
= ΔE×F/W×90
抗性淀粉（g/100g样品）（样品包含<10%RS）= ΔE×F×10.3/0.1×1/1000×100/W×162/180
= ΔE×F/W×9.27
非抗性淀粉含量（g/100g样品）=ΔE×F×100/0.1×1/1000×100/W×162/180
=ΔE×F/W×90
总淀粉含量=抗性淀粉含量+非抗性淀粉含量
ΔE=相对于空白试剂的吸光度值；
162/180=从测定获得的游离D-葡萄糖转换到淀粉中存在的脱水-D-葡萄糖的因子；
F=从吸光度值到微克的转换（在GOPOD反应中50μgD-葡萄糖的吸光度值是确定的，F=50（D-葡萄糖的μg数）除以这50μgD-葡萄糖的GOPOD吸光度值）；
100/0.1=体积校正（从100ml取0.1ml）； 1/1000=从ug到mg的转换；
W=分析样本的干重 =重量×（100-含水量）/100； 100/ W=RS在样品重量中百分比因子；
10.3/0.1=体积校正（从10.3 ml取0.1ml），对于含有0-10%RS，当孵育溶液时没有被稀释。