超过90%的新发结核病（TB）病例发生在卫生保健基础设施有限的低收入和中等收入国家。考虑到基于培养的检测法需要数周才能获得最终结果，而基于聚合酶链反应（PCR）的方法需要多步工作流程以及昂贵且笨重的设备，因此开发在资源有限的环境中使用的POC检测对于改善结核病诊断和治疗以及阻止结核病传播是十分有必要的。传统的TB筛查的样本来源是痰液，仅局限于肺结核（PTB）感染的检测，而不适用于肺外结核（EPTB）的筛查。此外，痰液检测对某些少菌性疾病高危人群的诊断作用有限（如幼儿和艾滋病毒感染者），其通常难以产生痰液或产生低负荷细菌的样本，导致较低的检测灵敏度。基于上述问题，Tulane大学医学系的Tony Hu团队在《Science Translational Medicine》上发表了题为Rapid tuberculosis diagnosis from respiratory or blood samples by a low cost, portable lab-in-tube assay的研究论文。本文报道了一种价格低廉，手持式电池供电的结核分歧杆菌（Mtb）检测装置，可在1小时内检测血清、唾液和痰液样本中检测多种形式的结核感染。本文通讯作者的研究方向是工程多组学、纳米医学、机制驱动的生物标志物发现和检测方法开发。

02 研究内容

本方法包含两部分装置，一次性使用的测定管包括测定管外壳、冻干形式的样品液化试剂（包括裂解缓冲液）、DNA结合膜，以及Mtb DNA检测所需的冻干形式的RPA和CRISPR-Cas12a组分；便携式可充电电池供电的测定装置由触摸屏控制，包含激光器，荧光成像滤光器，一个用于读取检测结果的摄像头，以及一个用于集成荧光成像和自动化分析的Raspberry Pi微处理器。

检测步骤如下，呼吸道样本首先被收集在测定管中，然后将测定管转移到便携式装置的孵育端口以进行灭活和样本前处理。然后，压下柱塞将裂解物加载到DNA结合膜上并在该处启动RPA-CRISPR反应。反应完成后，将测定管转移到分析端口以检测和分析所得到的荧光信号。检测时长为1小时，包含样本热裂解、RPA-CRISPR反应以及输出检测结果所需的全部步骤耗时。

对RPA-CRISPR荧光法进行了优化，考虑到荧光信噪比，选择Cy5而不是FAM作为探针的荧光基团；根据经典的RPA-CRISPR一锅法原理设计了不含PAM位点的gRNA2和gRNA3用以代替含有PAM的gRNA1，实现了更快的CRISPR反应速率；冻干RPA-CRISPR试剂后，考察了用于负载的不同材质纸基材料的优劣，最终选择孔径较大的棉质纸基材料用以原位冻干RPA-CRISPR相关试剂。然后细致考察了CRISPR反应最适的条件，使用EnGen LbCas12a时获得了较好的反应动力学曲线；在RPA缓冲体系中不添加CRISPR buffer即可获得最优的CRISPR反应速率；最优的Cas12a添加量为42 nM，Cas12a与gRNA的比例为1:1。由于全部的试剂都以冻干的形式保存，因此作者考察了不同保护剂的加入对稳定性的影响。结果显示当保护剂为蔗糖、海藻糖、葡聚糖或甘露醇时，RPA-CRISPR体系复溶后具有最高的活性；继续优化后发现仅加入蔗糖一种保护剂的实验组即可维持较长时间的稳定储存，可在室温存放2个月或4 ℃以下存放3个月之久。

接着，作者优化了装置设计，考察了不同包覆材料对传热效率的影响，以及反应时测定管自下而上不同高度处的温度情况，最终选择导热效率最高的聚苯乙烯泡沫塑料作为热传递材料。作者罗列了该检测装置的构建成本，其中占据主要成本的是光学元件，为690美金，占整个检测装置的87%；而可抛弃式的测定管仅需2.63美金每反应，因此相比大型检测仪器具有价格低廉的优势。

本方法对加标样本的检测线性范围为0.05-5000 pg/μL，还具有较高的特异性和单核苷酸多态性。在真实样本检测中，本方法的总检出率为81%（27个样本中的22个），其中肺结核性Mtb的检出率为83%（18个样本中的15个），肺外结核性Mtb的检出率为75%（8个样本中的6个）。相对的，传统痰液或灌洗液培养法对Mtb的检出率仅为55%（9个样本中的5个），而GeneXpert试剂盒的检出率也仅有68%（22个样本中的15个）。因此本方法具有较好的临床Mtb检出率，在更复杂的肺外感染Mtb案例中也保持了较好的检测性能。

此外，作者开发了一种基于DTT的样品前处理方法，针对痰液或血清中粘度较大的蛋白，利用DTT还原这些蛋白之间的二硫键，从而降低样本的粘度，使裂解后的核酸能够更好的被释放。结合了样品前处理后，本方法能够实现痰液中78.1 CFU/mL的Mtb检出，相当于38.2 copies/μL的IS 6110编码基因或2.4 copies/μL的Mtb基因组。该方法与GeneXpert Ultra的检测性能在同一数量级（15.6 CFU/mL），优于常规型GeneXpert（130 CFU/mL）。

03 研究小结

研究开发了一种用户友好的结核杆菌检测方法，可在1小时内特异性检测血液或呼吸道样本中的Mtb。该方法具有用于样品孵育、数据采集和结果分析的集成模块，支持儿童肺结核和肺外结核（基于血清）的结核病诊断和治疗监测以及成人的呼吸道样本分析。适用于利福平耐药变体Mtb菌株检测，与现有的诊断技术相比，该方法具有更高的灵敏度和良好的特异性。然而，该方法仍不符合WHO对POC检测结核病诊断的最低储存要求（在5-35 ℃下12个月，湿度70%），在处理血液样本时仍需预分离操作。