张锋实验室公布CRISPR程序检测COVID-19的详细方案

随着继续优化此方案，将上传更新的版本，有兴趣使用患者样品测试该方案的科研团队可以通过发送电子邮件，请求指导 sherlock@broadinstitute.org，并且可应要求提供有限数量的Cas13酶、crRNA和侧向报道基因的起始样品）
（重要说明：此协议不得用于临床目的，因为他们无法获取患者样本，因此无法使用真实的患者样本来验证该测定。）
一、概述
临床医生和科学家们目前虽然可以使用qPCR，来诊断新型冠状病毒COVID-19，但由于试剂和设备的不足，可能一定程度上减慢疾病检测的速度。为了帮助推进COVID-19的诊断，在此描述一种基于CRISPR的SHERLOCK(高灵敏度酶促解锁）技术，检测COVID-19的方案。使用合成的COVID-19病毒RNA片段，能够在20到200 aM（每微升输入10-100拷贝数）之间一致地检测COVID-19靶序列。从用于qRT-PCR测试的核酸提取开始，本检测方案分为三个步骤，并且可以在1小时内完成。
步骤（1）孵育25分钟（使用重组酶聚合酶扩增（RPA）试剂盒等温扩增提取的核酸样品）；
步骤（2）孵育30分钟（使用Cas13检测预先扩增的病毒RNA序列）；
步骤（3）孵育2分钟（使用的试纸/层析纸读取检验结果）。
以下各节详细介绍了所需的试剂和步骤。
二、标本和核酸提取：
应根据适当的生物安全程序收集患者样本，参考2020 CDC COVID-19方案，有关样本收集和后续核酸提取的详细信息。从步骤（1）开始，此方案的输入可以是与qRT-PCR分析中使用相同的核酸。
A材料和试剂
试剂：重组酶聚合酶扩增（RPA）试剂盒（TwistAmp®Basic；TABAS03KIT)；ProtoScript®II逆转录酶（M0368L）；裂解缓冲液（在ddH2O中为400mM Tris pH 7.4）；RNA酶抑制剂；T7 RNA聚合酶；核糖核苷酸溶液套装；氯化镁溶液；用于稀释Cas13蛋白原液的存储缓冲液（结合2.5 mL 1M Tris pH 7.4、6mL 5M NaCl，2.5 ml甘油和100μL1M DTT和38.9 ml ddH2O）；LwaCas13a蛋白；HybriDetect试纸条（MGHD 1)。
设备：37℃水浴锅、42℃水浴锅、微量离心机，适配1.5mL EP管。
引物：
靶向S基因的RPA扩增引物对
S-RPA-Forward_v1：
5’-GAAATATACTACGACGACTGATCACATACTACTTCTGTT TACATAGA-3’；
S-RPA-Reverse_v1:
5′-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3’；
针对Orf1ab引物对
Orf1ab-RPA-Forward_v1：
5’-GAATAATATACGACTACGGAGGAGTGTGAGATAGACATATActAAAC-3’；
Orf1ab-RPA-Reverse_v1:
5′-TAGTAAGACTAGAATTGTCTACATAAGCAGC-3’；
用于检测S基因的LwaCas13acrRNA
S-crRNA_v1：
5’-GuuuAgAccCCAAACAGGAGGACUCAAACAGCGACCACAGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3；
用于检测Orf1ab基因的LwaCas13acrRNA
Orf1ab-crRNA_v1：
5’-GuuuaGaCuCCAAACAGGAGGGACUACAUACACUCUCUUCUGUAAUUUUUAAACUAU-3’；
读出横向血的报告基因RNA：
Lateral-Flow-Reporter：
5′-/56-FAM / mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/-3’；
阳性对照序列（可以使用T7转录从合成的DNA寡核苷酸产生）：
新冠病毒S基因片段：
5’UAACAUCACUAGGUUUCAAACUUUACUUGCUUUACAUAGAAGUUAUUUGACUCCUGGUGAUUCUUCUUCAGGUUGGACAGCUGGUGCUGCAGCUUAUUAUGUGGGUUAUCUUCAACCUAGGACUUUCUCUUUAAUAAAUAUAAUGAAAAUGGAACCAUGACUGUACAGAUGCUGAGAU
新冠病毒Orf1ab基因片段：
5’GAAAUUAAUACGACUCACUAUAGGGACUCUUGAAACUGCUCAAAAUUCUGUGCGUGUUUACAGAAGGCCGCUAUAACAAUACUAGAUGGAAUUUCACAGUAUUCACUGAGACUCAUUGAAUUGCUAUGACUUCAUGAUGAUUCACAUCUGAUUUGGCUACUAACAUAUAUACUAUGACUUGAUCUGAUCUGAUCCUAU
B实验步骤：
提示：为防止样品污染，需使用两个不同的工作区域来执行步骤（1）和（2）。步骤（1）应该在前置放大区域中进行，其对污染非常敏感。请勿在步骤（1）的工作区域中打开扩增的样品，步骤（2）、步骤（3）需要一个单独的区域（扩增后区域）执行。所有反应应在指定温度下孵育之前在冰上进行。
步骤（1）等温扩增：
1、为了测试每个样品，设置两个RPA反应，分别检测S基因靶标和Orf1ab靶标。此外，可以使用合成病毒片段建立S基因和Orf1ab的阳性对照。还应建立不添加测试样品的阴性对照。使用RPA试剂盒中提供的29.5ul的Rehydration Buffer重悬每个冻干的RPA沉淀。

2、对于S基因，可以如下设置每个反应：

3、对于Orf1ab基因，可以如下设置每个反应：

4、充分混合后，在预热的水浴中于42°C孵育25分钟。孵育结束后，立即将EP管放回冰上，直到准备加入步骤（2）中的反应中。

步骤（2）使用Cas13检测病毒RNA序列
1、取一份LwaCas13a储备蛋白的等分试样（2 mg/mL，4 ul），使用122.5 uL的存储缓冲液重悬。
2、对于每个S基因RPA反应，按以下步骤建立Cas13检测反应：

3、对于每个Orf1ab基因RPA反应，如下设置Cas13检测反应：

4、设置完所有反应后，涡旋充分混合，并使用台式离心机离心，接下来在预热的37°C水浴锅中于孵育30分钟。孵育后，将反应管放回冰上，继续进行步骤（3）。
步骤（3）–通过试纸条直观地读取检测结果
1、步骤（2）之后，向每个20ul反应物中添加80ul HybriDetect分析缓冲液并充分混合，将稀释的反应液置于室温下的管架中。
2、将HybriDetect试纸条放入每个反应管中，然后等待反应流过试纸条。
3、阳性对照样品应显示两条线，而阴性对照样品应仅显示底线。
4、对于每个测试样品，检查S和Orf1ab基因是否都出现两行，表明新冠病毒结果呈阳性。
三、实验结果：
使用合成新冠病毒S基因和Orf1ab基因RNA片段的梯度稀释液，能够检测到每微升10-100拷贝的合成新冠病毒RNA序列的。以下是针对不同输入浓度的示例图像：

四、附加信息：
可以在以下参考中找到用于设置基于SHERLOCK检测的详细通用方案：
SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Kellner MJ, Koob JG, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, and Zhang F. Nature Protocols. 2019 Oct;14(10):2986-3012. doi: 10.1038/s41596-019-0210-2.

文章转载：http://www.sci666.com.cn/36773.html

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