1. 产品信息

2.产品简介

pCDH-Mito-EGFP/mCherry 质粒是一款专为线粒体可视化研究设计的慢病毒表达工具，依托成熟的慢病毒载体pCDH 骨架，通过细胞色素c 氧化酶亚基VIII（COX8A, Gene ID：1351）的线粒体靶向序列（位于COX8A 的N 端）和增强型绿色荧光蛋白EGFP 或者红色荧光蛋白 mCherry 融合，可以进行瞬时转染和慢病毒包装筛选稳转细胞系，实现对细胞线粒体的荧光标记与功能关联研究。

3.基因标记荧光探针光学性能

4. 关键元件功能说明

(1) 核心靶向元件：细胞色素c 氧化酶亚基VIII 线粒体靶向序列（COX8MTS）

来源：源自哺乳动物细胞色素c 氧化酶（线粒体呼吸链复合物IV）的亚基VIII，是天然的线粒体基质靶向信号。

功能与优势：该序列含约25 个氨基酸，引导融合蛋白通过线粒体膜间隙，最终定位到线粒体基质，实现EGFP 或者mCherry 融合蛋白在线粒体基质中的特异性表达，而非游离于细胞质或其他细胞器，且不影响融合蛋白（EGFP 或者mCherry）的折叠与荧光活性，在细胞固定后也可以维持荧光。

(2) 其他关键元件

CMV 启动子：在人、小鼠、大鼠等多种哺乳动物细胞中均能驱动下游基因（Mito-EGFP/ mCherry 融合基因）高效表达，无需细胞特异性激活因子。

氨苄青霉素抗性基因（Amp⁺）：在大肠杆菌培养中，仅含该质粒的细菌可在含氨苄青霉素（终浓度50-100 μg/mL）的LB 培养基中存活，用于筛选阳性克隆。

嘌呤霉素抗性基因（Puro）：在真核细胞中，含该质粒的细胞可耐受嘌呤霉素（终浓度1-10 μg/mL，需根据细胞类型预实验优化），用于筛选稳定整合质粒的细胞系。

5. 质粒溶解及转化

(1) 质粒溶解（干粉形式）

收到质粒干粉后，先于5000 rpm 离心30 s--1min（避免开盖时粉末飘散）。加入无菌双蒸水，2.5 µg 包装可以加20 ul 轻轻混匀后进行溶解，可以取出1ul 自行进行质粒转化扩增。50 µg（具体体积可根据所需浓度调整，建议终浓度≥ 300 ng/μL，方便进行瞬时转染或者慢病毒包装）。

(2) 大肠杆菌转化（获取大量质粒）

A. 取100 μL 感受态细胞（如DH5α、TOP10 等）置于冰上解冻，避免手触管壁。加入 1 μL质粒溶液（约100 ng），轻轻弹击离心管底部混匀，冰浴30 min（期间无需 震荡）。

B. 42℃水浴热激45-60 s（具体根据感受态细胞设置），立即放回冰上放置2 min（骤 冷促进质粒进入细胞）。

C. 加入900 μL 无抗LB 液体培养基，37℃、180-200 rpm 振荡培养30--60 min（使抗 性基因表达）。

D. 5000 rpm 离心5 min，弃去800 μL 上清，剩余100 μL 上清重悬细菌沉淀，均匀 涂布于含 Amp+（终浓度100 μg/mL）的LB 固体平板上。也可以省略离心步骤，取 第（3）步骤50ul菌液涂布平板。

E. 平板倒置，37℃恒温培养12-16h（培养超过18 h 可能出现卫星菌落）。

F. 从平板上挑取单菌落（选择边缘清晰、大小适中的菌落，避免挑取融合菌落），分别 接种到适量含氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB 液体培养基中。于37℃、220 rpm 振 荡培养12-14 h，选择合适的无内毒素提取试剂盒进行质粒抽提。

提取后可以通过两种方式验证质粒正确性：

酶切验证：用针对融合片段的限制性内切酶（XbaI/NheI(两个任选其一)+NotI）双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测（预期片段大小约850 bp，含COX8 MTS、linker 和荧光蛋白）；

测序验证：送测序公司，测序正向引物和反向引物如下所示：

测序引物：

CMV-F: 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'；

PCDH‐R：5'-CTCGAGTCGACGGTATCGATAAGCTT-3'。

6. 应用场景

(1) 线粒体形态与动态变化观察

这是该质粒最基础的应用，核心是通过EGFP 或者mCherry 荧光信号直观呈现线粒体的“形态特征”与“动态行为”，适用于多种生理或病理条件下的线粒体变化研究。

(2) 线粒体功能关联分析

线粒体形态与功能高度相关（如管状线粒体呼吸功能正常，碎片化线粒体常伴随功能损伤），该质粒可通过荧光信号间接反映线粒体功能，或与功能探针联合使用实现“形态——功能”同步分析。

(3) 线粒体相关基因功能验证

当研究“线粒体融合/分裂、自噬、代谢”相关基因（如MFN2、DRP1、PINK1）时，该质粒可作为“报告工具”，通过观察荧光标记的线粒体形态变化，验证目标基因的功能。

(4) 稳定细胞系构建

通过慢病毒感染目标细胞，再用嘌呤霉素筛选（pCDH 载体含嘌呤霉素抗性基因），可获得“100%表达EGFP 或者mCherry 且线粒体特异性标记”的稳定细胞系，避免每次实验都进行转染，提高实验重复性。

(5) 线粒体异常细胞分选

若细胞群体中存在“线粒体形态异常”的亚群（如肿瘤干细胞中线粒体多为碎片化），可通过流式细胞仪分选“EGFP 或mCherry 荧光强度异常或分布异常”的细胞，获得纯亚群后进行转录组、代谢组等下游分析，探究线粒体异常与细胞功能的关联。

(6) 共培养体系中线粒体转移追踪

在细胞共培养实验中（如免疫细胞与肿瘤细胞共培养），可仅标记其中一种细胞的线粒体（如用该质粒标记肿瘤细胞），通过荧光成像观察共培养过程中肿瘤细胞线粒体的形态变化（如是否因免疫攻击导致碎片化），明确细胞间相互作用对线粒体的影响。

7. 注意事项

元件特异性注意：COX8 MTS 是线粒体基质靶向序列，仅能引导蛋白进入线粒体基质，若需靶

向线粒体内膜或外膜，需更换其他靶向序列（如Tom20 靶向外膜），不可混用。

转染效率优化：不同细胞系对转染试剂的敏感性不同，在转染细胞时，应根据细胞类型和实验需求选择合适的转染方法和转染条件，以提高转染效率和细胞存活率。建议通过“质粒浓度梯度+ 转染试剂体积梯度”预实验，确定最佳转染条件，避免因试剂过量导致细胞毒性。

稳筛选：在筛选稳定细胞系时，嘌呤霉素的浓度和筛选时间需要根据具体情况进行优化，以确保能够筛选出稳定表达的细胞株，同时避免对细胞造成过度的损伤。

安全与合规：该质粒仅用于科学研究（如线粒体形态观察、线粒体功能相关实验），严禁用于临床诊断、治疗或任何商业用途；操作时需遵守生物安全实验室规定，避免质粒污染环境。

长期储存：提取后的质粒若需长期储存（超过6 个月）可以放于-20℃，如在-80℃保存可降低降解风险。