简介

淀粉是人类饮食中主要的能量来源，它在多种食物中富含，如谷类、豆类、根茎类蔬菜和水果。淀粉在许多加工类食品和动物饲料中也占有相当大的比例，并以天然或化学改性的形式在工业上得到广泛应用。淀粉测定方法分为酸水解法和酶分析法，其中酸水解只能应用干纯淀粉样品。针对不同的样品，酶分析方法在前处理步骤上有所不同。经典的AACC76-11法采用淀粉在高压蒸汽灭菌锅中及含水的条件下凝胶化，并用淀粉葡糖苷酶将淀粉转化为葡萄糖，再测定葡萄糖含量，采用AACC76-11法会导致许多样品和材料中包括高直链淀粉、玉米淀粉和谷物制品淀粉含量检测结果偏低。近来，我们对检测方法进行了改进，使耐热α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶可以在相同的pH（pH=5.0）下进行孵育，这样简化了测定步骤，并将麦芽酮糖生成的可能性降到最低。淀粉总量试剂盒可测定大部分食品、饲料、植物和谷物制品(天然或加工过的)，对于大部分样品（如小麦粉）中的淀粉在孵育中（大约100℃并加入耐热α-淀粉酶）会完全溶解；对于含有大量抗性淀粉的样品（如高直链玉米淀粉）需用1.7M NaOH或热DMSO进行预溶解；而含有可溶性淀粉或麦芽糊精的样品，不需要用耐热-淀粉酶处理。

产品性能

特异性:可用于测定-葡聚糖(包括淀粉、糖原、植物糖原和非抗性麦芽糊精)

灵敏度:最小吸光度差异为0.010吸光度单位。这相当于当样品质量为100mg时，总淀粉含量为0.09mg。

检测限:吸光度差异为0.020吸光度单位。这相当于样品质量为100mg时，总淀粉含量为0.18mg。

检测范围:在5-100 μg D-葡萄糖范围内呈线性关系。重复检测同一样品溶液其吸光度值会有0.005-0.010吸光度单位的差异，如果样品经过稀释，计算结果时需要乘以相应的稀释系数（F）。

检测原理

（1）耐热a-淀粉酶将淀粉水解为可溶性的、有支链的、无支链的麦芽糊精

 （2）含大量抗性淀粉的样品可以加入2 mol/L KOH混合均匀，在4℃下使抗性淀粉预溶解，然后用醋酸钠缓冲液中和，最后用α-淀粉酶处理。也可以在100℃下，用DMSO溶解，再加入α-淀粉酶处理生成麦芽糊精。

（3）淀粉葡糖苷酶(AMG)将麦芽糊精定量水解成D-葡萄糖

（4）D-葡萄糖被葡萄糖氧化酶氧化成D-葡萄糖酸盐，并释放等摩尔的H₂O₂。再用过氧化物酶催化H₂O₂反应，产生的昆亚胺染料含量用比色法测定。

（5）过氧化氢被过氧化物酶催化生成水和氧气，同时对羟基苯甲酸和4-氨基安替比林被氧化生成醌亚胺；这一过程可以通过比色反应进行测定。

如果样品中含高水平的D-葡萄糖和麦芽糊精，可在测定前用80%乙醇处理。一个样品的检测可以在70分钟内完成。

保存条件

未配制前在规定存储条件下6个月内有效，配制使用后在规定存储条件下3个月内有效（各组分详细储存条件见瓶身）。

试剂盒组成与配置

1. 所需的仪器和用品：

2. 可见分光光度计/酶标仪、10mm玻璃比色皿/96孔板、水浴锅、可调式移液器、离心机、磁力搅拌器、涡旋仪等

2. 需配试剂：

a、 醋酸钠缓冲液（100 mM，pH 5.0）含CaCl₂（5 mM）：在900 ml蒸馏水中加入5.8 ml冰醋酸，后加入0.74 g二水合CaCl₂并溶解，使用NaOH溶液将pH值调节到5.0，使用蒸馏水定容至1L，并在4°C下储存缓冲液。

b、 醋酸钠缓冲液（200mM，pH 4.5）含CaCl₂（5 mM）：向900 ml蒸馏水中添加11.6 ml冰醋酸，后加入0.74 g二水合CaCl₂并溶解，使用氢氧化钠溶液将pH值调整为4.5，使用蒸馏水定容至1L，并在4°C下储存缓冲液。

c、 醋酸钠缓冲液（600 mM，pH 3.8）含CaCl₂（5 mM）：向1600 ml蒸馏水中添加69.6 ml冰醋酸，后加入1.48 g二水合CaCl₂并溶解，使用氢氧化钠溶液将pH值调节至3.8，使用蒸馏水定容至2L，并在4°C下储存缓冲液。

d、 NaOH溶液（1.7 M）：称取68g氢氧化钠，加入900ml去离子水，搅拌溶解，将容量调整为1L并储存在密封容器中，室温保存。

e、 MOPS缓冲液（50mM，pH7.0）含CaCl₂（5mM）、叠氮化钠（0.02%）：取11.55g MOPS（钠盐, Sigma cat. M-9381）加入900ml蒸馏水溶解, 后加入二水合CaCl₂ 0.74g，用HCl调节pH=7.0， 称取叠氮化钠0.2g 完全溶解, 然后调整到1L，并在4℃保存。

注：在调整pH值之前，不得添加叠氮化钠，叠氮化钠酸化会释放出有毒气体。

淀粉含量测定

（a） 不含抗性淀粉的样品总淀粉含量的测定

1. 碾磨谷物、植物或食品，使用0.5mm孔径的筛网进行分筛；

2. 准确称取100 mg待测样品，一式两份（一份作为空白管）放入50ml离心管中；

3. 向两支离心管中分别加入10ml缓冲液a：醋酸钠缓冲液（100mM，pH 5.0）含CaCl2（5mM），使用涡旋移混匀5s；

4. 向其中一个离心管（样品管）中添加0.1 ml未稀释的试剂一，向第二根离心管（空白管）中加入0.1ml缓冲液a：醋酸钠缓冲液（100mM，pH 5.0）含CaCl₂（5mM），将管中液体混合均匀；

5. 轻轻旋上盖子，将离心管转移到100℃沸水浴中处理2min后，拧紧瓶盖；在涡旋仪上用力混合离心管内容物，过5min后，再次将离心管内容物涡旋5s；然后将试管放回100℃沸水浴中15min，从沸水浴中取出试管，在涡旋仪上剧烈涡旋5s；最后将离心管放在50°C的水浴中平衡管内温度至少5min；

6. 向样品管中添加0.1 ml未稀释试剂二，涡旋3s，向空白管中添加0.1 ml缓冲液a：醋酸钠缓冲液（100 mM pH 5.0）含CaCl₂（5 mM）；轻轻混匀后在50°C下处理样品30min；

7. 从水浴锅中取出离心管，室温冷却后将管子倒置几次，使管盖内侧的冷凝水与管内的液体混合；

8. 从离心管（样品管和空白管）中分别取出2.0 ml溶液转移到5ml EP管中，以13000 rpm的转速离心EP管5min并静置5min；吸取1.0 ml上清液转移到新的15ml离心管中，加入4 ml缓冲液a：醋酸钠缓冲液（100 mM，pH 5.0）含CaCl₂（5 mM），并将管内液体混合均匀；

9. 分别从15ml离心管（样品管和空白管）中吸取溶液0.05 ml到新的5ml EP管中；接着向管中加入1.5 ml 试剂四，轻轻混匀，在50°C下培养20min；反应结束后吸取200ul液体转移至96孔板中，于510nm处读数；

同时孵化：

标准管：0.05 ml葡萄糖标准溶液（1.0 mg/ml）加1.5 ml试剂四，一式四份；

空白管：0.05 ml 缓冲液a：乙酸钠缓冲液（100 mM，pH 5.0）含CaCl₂（5 mM）和1.5 ml试剂四，一式两份。

与样品管和空白管同时在50°C下培养20min；反应结束后吸取200ul液体转移至96孔板中，于510nm处读数；

10. 计算淀粉含量。

注：对于本提取方案，最终提取体积（EV）=10.2   稀释度（D）=1、5或11

注1：如果样品的吸光度值小于0.05，步骤8中离心后吸取上清，无需再添加缓冲液进行稀释；如果吸光度值大于0.60，吸取离心后上清，可以加入10ml缓冲液a进行稀释（稀释度（D）=1、5或11）。

注2：当分析含有约20-30%淀粉的草和青贮饲料等纤维样品时，使用搅拌机研磨样品，研磨约60秒（直到样品均匀为止）。步骤2中称取样品增加至500 mg进行后续实验；步骤5中在100°C下沸水浴的处理时间延长至60min；步骤8中需要对样品稀释20倍再进行后续检测（稀释度（D）=20）。

（b） 含抗性淀粉样品总淀粉含量的测定

1. 碾磨谷物、植物或食品，使用0.5mm孔径的筛网进行分筛；

2. 准确称取100mg待测样品，一式两份（一份作为空白管）放入50ml离心管中；

3. 向离心管中加入0.2ml 80%乙醇混合均匀，使样品在离心管中均匀分散，该步骤非常重要；

4. 向离心管中添加2ml 1.7M NaOH溶液，并在涡旋仪上涡旋混匀15s；之后将离心管放在冰水浴中处理15min，在此期间需要间歇性在涡旋仪上涡旋3-5次,确保样品中没有结块；

5. 向离心管中添加8 ml缓冲液c：醋酸钠缓冲液（600 mM，pH 3.8）含CaCl₂（5 mM）,在涡旋仪上涡旋混匀；

6. 立即向样品管中添加0.1 ml未稀释的试剂一，然后再添加0.1 ml试剂二。向第二根离心管（空白管）中添加0.2 ml缓冲液a：醋酸钠缓冲液（100 mM，pH 5.0）含CaCl₂（5 mM），旋紧两个离心管管盖并涡旋混匀3s并将离心管放置在50°C下培养30min；

7. 从水浴锅中取出离心管，室温冷却后将管子倒置几次，使管盖内侧的冷凝水与管内的液体混合；

8. 从离心管（样品管和空白管）中分别取出2.0 ml溶液转移到5ml EP管中，以13000 rpm的转速离心EP管5min并静置5min；吸取1.0 ml上清液转移到新的15ml离心管中，加入4 ml缓冲液a：醋酸钠缓冲液（100 mM，pH 5.0）含CaCl₂（5 mM），并将管内液体混合均匀；

9. 分别从15ml离心管（样品管和空白管）中吸取溶液0.05 ml到新的5ml EP管中；接着向管中加入1.5ml 试剂四，轻轻混匀，在50°C下培养20min；反应结束后吸取200ul液体转移至96孔板中，于510nm处读数；

同时孵化：

标准管：0.05 ml葡萄糖标准溶液（1.0 mg/ml）加1.5ml试剂四，一式四份。

空白管：0.05 ml缓冲液a：乙酸钠缓冲液（100 mM，pH 5.0）加CaCl₂（5 mM）和1.5 ml试剂四，一式两份。

与样品管和空白管同时在50°C下培养20min；反应结束后吸取200ul液体转移至96孔板中，于510nm处读数；

10. 计算淀粉含量。

注：对于本提取方案，最终提取体积（EV）=10.4   稀释度（D）=1、5或11

注1：如果样品的吸光度值小于0.050，步骤8中离心后吸取上清，无需再添加缓冲液进行稀释；如果吸光度值大于0.60，吸取离心后上清，可以加入10ml缓冲液a进行稀释（稀释度（D）=1、5或11）。

（c） 不含抗性淀粉、D-葡萄糖和/或麦芽糊精的样品总淀粉含量的测定

1. 碾磨谷物、植物或食品，使用0.5mm孔径的筛网进行分筛；

2. 准确称取100 mg待测样品，一式两份（一份作为空白管）放入50ml离心管中；

3. 向离心管中加入0.2ml 80%乙醇混合均匀，使样品在离心管中均匀分散，该步骤非常重要；

4. 向离心管中添加3 ml稀释后的试剂一（将试剂一用MOPS缓冲液（50 mM，pH 7.0）含CaCl₂（5 mM）稀释30倍），将离心管放入100℃沸水浴中孵育6min，在此期间需要间歇性在涡旋仪上涡旋3-5次充分混匀；

5. 将离心管转入50°C的水浴锅中，温育5min；之后加入4 ml缓冲液b：醋酸钠缓冲液（200 mM，pH 4.5）含CaCl₂（5 mM），然后加入0.1ml试剂二，在涡旋仪上涡旋混匀，并在50°C下培养30min；

6. 将离心管中的全部内容物转移到100 ml容量瓶中，用缓冲液b：醋酸钠缓冲液（200 mM，pH 4.5）含CaCl₂（5 mM）定容至100ml，并将瓶中液体混合；

7. 从容量瓶（样品管和空白管）中分别取出2.0 ml溶液转移到5ml EP管中，以13000 rpm的转速离心EP管5min并静置5min； 

8. 分别从5ml EP管（样品管和空白管）中吸取溶液0.05 ml到新的5ml EP管中；接着向管中加入1.5 ml 试剂四，轻轻混匀，在50°C下培养20min；反应结束后吸取200ul液体转移至96孔板中，于510nm处读数；

同时孵化：

标准管：0.05 ml葡萄糖标准溶液（1.0 mg/ml）加1.5 ml试剂四，一式四份。

空白管：0.05 ml缓冲液a：乙酸钠缓冲液（100 mM，pH 5.0）加CaCl₂（5 mM）和1.5ml试剂四，一式两份。

与样品管和空白管同时在50°C下培养20min；反应结束后吸取200ul液体转移至96孔板中，于510nm处读数；

9. 计算淀粉含量。

注：对于本提取方案，最终提取体积（EV）=100  稀释度（D）=1

（d） 含有抗性淀粉但不含D-葡萄糖和/或麦芽糊精的样品总淀粉含量的测定

1. 碾磨谷物、植物或食品，使用0.5mm孔径的筛网进行分筛；

2. 准确称取100 mg待测样品，一式两份（一份作为空白管）放入50ml离心管中；

3. 向离心管中加入0.2ml 80%乙醇混合均匀，使样品在离心管中均匀分散，该步骤非常重要；

4. 向离心管中加入2ml二甲基亚砜（DMSO），并在涡旋仪上涡旋混匀，将离心管放入100℃沸水浴中处理5min，在此期间需要间歇性在涡旋仪上涡旋3-5次充分混匀；

5. 向离心管中添加3 ml稀释后的试剂一（将试剂一用MOPS缓冲液（50 mM，pH 7.0）含CaCl₂（5 mM）稀释30倍），将离心管放入100℃沸水浴中孵育6min，在此期间需要间歇性在涡旋仪上涡旋3-5次充分混匀；

6. 将离心管转入50°C的水浴锅中，温育5min；之后加入4 ml缓冲液b：醋酸钠缓冲液（200 mM，pH 4.5）含CaCl₂（5 mM），然后加入0.1ml试剂二，在涡旋仪上涡旋混匀，并在50°C下培养30min；

7. 将离心管中的全部内容物转移到100 ml容量瓶中，用缓冲液b：醋酸钠缓冲液（200 mM，pH 4.5）含CaCl₂（5 mM）定容至100ml，并将瓶中液体混合；

8. 从容量瓶（样品管和空白管）中分别取出2.0 ml溶液转移到5ml EP管中，以13000 rpm的转速离心EP管5min并静置5min； 

9. 分别从5ml EP管（样品管和空白管）中吸取溶液0.05 ml到新的5ml EP管中；接着向管中加入1.5 ml 试剂四，轻轻混匀，在50°C下培养20min；反应结束后吸取200ul液体转移至96孔板中，于510nm处读数；

同时孵化：

标准管：0.05 ml葡萄糖标准溶液（1.0 mg/ml）加1.5 ml试剂四，一式四份。

空白管：0.05 ml缓冲液a：乙酸钠缓冲液（100 mM，pH 5.0）加CaCl₂（5 mM）和1.5ml试剂四，一式两份。

与样品管和空白管同时在50°C下培养20min；反应结束后吸取200ul液体转移至96孔板中，于510nm处读数；

10. 计算淀粉含量。

注：对于本提取方案，最终提取体积（EV）=100  稀释度（D）=1

注1：二甲基亚砜作为皮肤刺激物，因此应谨慎使用。它通过皮肤吸收，会对皮肤和眼睛造成刺激。使用时穿戴防护品并避免溅出溶剂，尽可能在通风柜中使用。

（e） 含有D-葡萄糖和/或麦芽糊精的样品总淀粉含量的测定

用乙醇洗涤去除D-葡萄糖和麦芽糊精

[注：麦芽糊精在乙醇水溶液中的溶解度主要取决于麦芽糊精的DP（聚合度）范围、最终乙醇浓度和溶液温度]。

1. 碾磨谷物、植物或食品，使用0.5mm孔径的筛网进行分筛；

2. 准确称取100 mg待测样品，一式两份（一份作为空白管）放入50ml离心管中；

3. 向50ml离心管中加入5.0 ml 80%乙醇并在80-85°C下培养5分钟，使用涡旋仪涡旋混匀溶液，并补加5 ml 80%乙醇；

4. 在台式离心机上，以3250xg离心10min，去除上清，保留沉淀；

5. 向离心管中加入5 ml 80%乙醇中重悬沉淀，并使用涡旋仪涡旋混匀，再加入5ml 80%乙醇，倒置混合，按照步骤4再次离心，并小心地倒出上清液；

6. 向离心管中添加3 ml稀释后的试剂一（将试剂一用MOPS缓冲液（50 mM，pH 7.0）含CaCl₂（5 mM）稀释30倍），将离心管放入100℃沸水浴中孵育6min，在此期间需要间歇性在涡旋仪上涡旋3-5次充分混匀；

7. 将离心管转入50°C的水浴锅中，温育5min；之后加入4 ml缓冲液b：醋酸钠缓冲液（200 mM，pH 4.5）含CaCl₂（5 mM），然后加入0.1ml试剂二，在涡旋仪上涡旋混匀，并在50°C下培养30min；

8. 将离心管中的全部内容物转移到100 ml容量瓶中，用缓冲液b：醋酸钠缓冲液（200 mM，pH 4.5）含CaCl₂（5 mM）定容至100ml，并将瓶中液体混合；

8. 从容量瓶（样品管和空白管）中分别取出2.0 ml溶液转移到5ml EP管中，以13000 rpm的转速离心EP管5min并静置5min； 

9. 分别从5ml EP管（样品管和空白管）中吸取溶液0.05 ml到新的5ml EP管中；接着向管中加入1.5ml 试剂四，轻轻混匀，在50°C下培养20min；反应结束后吸取200ul液体转移至96孔板中，于510nm处读数；

同时孵化：

标准管：0.05 ml葡萄糖标准溶液（1.0 mg/ml）加1.5 ml试剂四，一式四份。

空白管：0.05 ml缓冲液a：乙酸钠缓冲液（100 mM，pH 5.0）加CaCl₂（5 mM）和1.5ml试剂四，一式两份。

与样品管和空白管同时在50°C下培养20min；反应结束后吸取200ul液体转移至96孔板中，于510nm处读数；

10. 计算淀粉含量。

注：对于本提取方案，最终提取体积（EV）=100  稀释度（D）=1

（f） 淀粉以可溶性或悬浮形式存在的样品中总淀粉含量的测定

1. 将液体样品适量转入50ml离心管中通过涡旋仪混匀，彻底混合样品。可以加热或使用均质仪以获得样品的均匀悬浮液；

2. 使用移液器吸取100mg样品转入新的50ml离心管中，一式两份（一份作为空白管）；

后续步骤于提取方案（a）中步骤3~步骤10相同。

        注：对于本提取方案，稀释样品体积（DSV）=10.2 ml，稀释度（D）=1、5或11，样品体积（SV）=5ml

（g） 悬浮态含抗性淀粉样品中总淀粉含量的测定

1. 将液体样品适量转入50ml离心管中通过涡旋仪混匀，彻底混合样品。可以加热或使用均质仪以获得样品的均匀悬浮液；

2. 使用移液器吸取100mg样品转入新的50ml离心管中，一式两份（一份作为空白管）；

后续步骤于提取方案（b）中步骤3~步骤10相同。

注：对于本提取方案，稀释样品体积（DSV）=12.2 ml，稀释度（D）=1、5或11，样品体积（SV）=2 ml

计算：

1.固体样品的计算（mg）：

淀粉含量，% = ΔA × F×（EV/0.1）×（1/1000）×D×（100/W）×（162/180）

=ΔA ×F ×EV ×（D/W) x 0.90

其中：

ΔA=相当于试剂空白读取的吸光光度值(反应) ；       

F =吸光光度值转换为葡萄糖重量(ug)的因子（100ug D-葡萄糖的重量/100μg D-葡萄糖的吸光光度值）；

EV=最终体积样品提取量:流程（a）为10.2 ml，流程（b）为10.4ml，流程（c）和（d）为100ml;                  0.1=用于检测的样品体积；      

D=样品溶液的进一步稀释倍数（未稀释、稀释5倍或稀释11倍）；    

（1/1000）=从ug到mg的转换；

（100/W）=一定重量干粉中淀粉含量的百分比值；

（162/180）=淀粉中游离的D-葡萄糖转化为D-葡萄糖酐的因子；               

淀粉含量，%(干重)=淀粉含量，%(上述算法结果) ×100/（100-含水量，%)

2.液体样品的计算（mg/100 ml）：

淀粉  = ΔA×F ×（DSV/SV）×（100/0.1）×（1/1000）×（162/180）×D

= ΔA × F×DSV/SV×0.9

ΔA=相当于试剂空白读取的吸光光度值(反应) ；       

F =吸光光度值转换为葡萄糖重量(ug)的因子（100μg D-葡萄糖的重量/100μg D-葡萄糖的吸光光度值）；

DSV=稀释样品体积（即加入醋酸盐缓冲液、α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶后的样品体积）；

SV=分析用样品的体积：流程（f）为5 ml，流程（g）为2 ml；  

100=换算成100ml样品体积；

0.1=用于检测的样品体积；           

（1/1000）=从μg到mg的转换；

（162/180）=淀粉中游离的D-葡萄糖转化为D-葡萄糖酐的的因子；               

D=样品溶液的进一步稀释（未稀释、稀释5倍或稀释11倍）     

淀粉（g/100g样品）=mg/100ml×100/样品干重（mg/ml)