正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定                                             

测定意义：

XOD（EC 1.17.3.2）催化黄嘌呤氧化生成尿酸和超氧阴离子，是活性氧主要来源之一；同时也是核苷酸代谢的关键酶之一。XOD主要分布于哺乳动物的心，肺，肝脏等组织中，当肝功能受损时，XOD大量释放到血清中，对肝损害的诊断具有特异性的意义。

测定原理：

XOD催化黄嘌呤产生尿酸，尿酸在290nm下有特征吸收峰。

试剂组成和配制：

需自备仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵、冰和蒸馏水。

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至290nm，蒸馏水调零。

2、 XOD检测工作液的配制：用时在每瓶试剂二中加入15ml试剂一，充分混匀，待用；现配现用；

3、 测定前将XOD检测工作液在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min以上。

4、 准备96孔UV板一块（非普通酶标板，普通酶标板只能透过可见光，不能透过紫外光，检测波长小于340nm务必使用UV板）。

5、在微量石英比色皿或96孔UV板中加入10μl样本和250μl工作液，立即混匀并计时，记录290nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。计算ΔA＝A2-A1。

XOD活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）XOD计算：

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化产生1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD（nmol/min/ml）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷V样÷T=2131×ΔA

2、组织、细菌或细胞中XOD计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T =2131×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V样÷V样总）÷T=2131×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V样÷V样总）÷T=4.26×ΔA

V反总：反应体系总体积，2.6×10^-4 L；ε：尿酸摩尔消光系数，1.22×10⁴ L/ mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；500：细胞或细菌总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

标准条件下的回归曲线为y = 1.2396x + 0.0259，R² = 0.9977；其中y为△A，x为NADPH浓度nmol/ml

1、血清（浆）中NADPH含量计算

NADPH含量(nmol/ml）= [(△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 16.1× (△A -0.0259）

2、组织、细菌或细胞中NADPH含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V1×Cpr)= 0.8× (△A -0.0259）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADPH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(W×V1÷V2)=1.6× (△A -0.0259）÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADPH (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.003× (△A -0.0259）

V1：加入反应体系中样本体积，0.05ml；V2：加入提取液体积，2ml；V3：加入血清（浆）体积：0.1ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。